Embriología Molecular y Diferenciación Celular

Jean Brachet

La Recherche, enero 1973


I. Las etapas de la embriología

En el transcurso del desarrollo embrionario, hacen su aparición formas y estructuras nuevas: esto es lo que se entiende por morfogénesis. Pero sería un error creer que la aparición de nuevos órganos se limita a cambios estrictamente morfológicos, apoyándose únicamente en la forma y la estructura: la morfogénesis está estrechamente ligada también al nacimiento de nuevas funciones fisiológicas y a transformaciones profun­das sobre el plano bioquímico. Por ejemplo, es fácil reconocer, al microscopio, las células contráctiles del corazón desde el momento en que este órgano se forma en el joven embrión: presentan una estriación típica, que muestra la figura 2. Pero estas células no serían células cardiacas si no estuvieran dotadas de la capacidad de contraerse de manera autónoma, capacidad de la que están desprovistas las fibras -igualmente estriadas que forman nuestros músculos voluntarios; las células cardiacas y musculares no serían capaces de contraerse si no contuvieran "proteínas Contráctiles", la actina y la miosina. Son, en el fondo, estas proteínas particulares las que dan su sello específico (contractilidad, estriación) a las células cardiacas. Sucede lo mismo con los glóbulos rojos, que- deben su color a la presencia de hemoglobina. Sin esta proteína pigmentada, los glóbulos rojos serían incapaces de cumplir su función, que consiste en transportar el oxígeno del pulmón hacia los otros órganos. Los glóbulos rojos y las células cardiacas tienen un origen embrionario muy próximo; lo que los diferencia fundamentalmente es que estas células tienen sintetiza­das proteínas particulares, altamente especificas (hemoglobina o actina y miosina). El problema de la diferenciación celular está, pues, mirándolo


Figura 1. Acetabularia es un alga común en el Mediterráneo. Esta célula única es gigante; mide 5 cm de largo y no posee más que un solo núcleo. Este último es sorprendentemente resistente. No contento con sobrevivir varios meses, es capaz de crecer e incluso de formar un "sombrero" nuevo, como testimonian las cuatro sombrillas representadas aquí: nacieron sobre fragmentos anucleados después de que el alga se hubiera cortado en dos. La morfología del sombrero es controlada por lo,, genes del núcleo; sin embargo, un sombrero típico se forma en su ausencia... Esta paradoja y muchas otras son resueltas poco a poco gracias al rápido avance de la embriología molecular.


Figura 2. Las fibras musculares del corazón constituyen un ejemplo típico de la diferenciación celular que se produce en el curso del desarrollo embrionario. Se ve, al microscopio, la estriación característica de las fibras musculares cardiacas. Esta estriación se vuelve a encontrar en los músculos voluntarios: es debida a la acumulación de proteínas específicas (actina y miosina) que son capaces de contraerse. La aparición de estas proteínas contráctiles causa la diferenciación a la vez bioquímica y morfológica del músculo. Cómo puede ser que el huevo fecundado dé lugar a células tan especializadas como las fibras musculares cardiacas es uno de los grandes misterios de la biología actual.


bien, unido al de la síntesis de proteínas específicas en el transcurso del desarrollo embrionario. Comprender cómo y por qué estas proteínas se sintetizan en una región bien determinada del embrión y en un estadio concreto de su desarrollo es una de las tareas principales de la embriología molecular: ésta se propone, en resumen, dar cuenta de la diferenciación embrionaria en función de las propiedades químicas y físicas de las macromoléculas (ácidos nucleicos y proteínas) constitutivas de cada tipo celular.

El problema fundamental que nos plantea la diferenciación embrionaria (y está lejos de ser resuelto) es el siguiente: ¿cómo puede ser que de un huevo fecundado, que ha recibido sus genes de su padre y de su madre, puedan nacer todos los órganos que están presentes en el adulto? ¿Cómo puede ser que un número restringido de células -que deberían, en principio, poseer los mismos genes que las otras- se ponga, en un momento dado, a sintetizar hemoglobina y a diferenciarse en glóbulos rojos? Si se eliminan estas "células madre" de los glóbulos rojos por vía quirúrgica, el embrión es condenado a morir de anemia más pronto o más tarde, ya que las células vecinas son incapaces de sintetizar hemoglobina y convertirse en glóbulos rojos, aunque en principio dispongan de la misma información genética.

Figura 3. Representación esquemática de los gradientes morfogenéticos y de la teoría de Morgan sobre la diferenciación embrionaria.

A. El huevo virgen o fecundado presenta ya un gradiente de polaridad: arriba, el polo animal (A), rico en ribosomas, es la de sede de importantes síntesis proteicas; abajo, el polo vegetativo (Vg) está lleno de materiales de reserva (vitelo). El polo animal formará más tarde la cabeza del embrión y cl polo vegetativo, su cola En el huevo fecundado, se puede distinguir el lado dorsal (D) del lado ventral (V). El núcleo del huevo recientemente fecundado está inactivo.

En la gastrulación, las mitades dorsal (D) y ventral(V) se reconocen con facilidad. Los núcleos, que eran inicialmente idénticos, se modifican: los genes se hacen activos en la mitad dorsal, mientras que quedan inactivos en la mitad ventral. Un gradiente

dorso-ventral de actividad genética (síntesis de RNA) se superpone al gradiente inicial de polaridad.

C. Los gradientes están más acusados en el joven renacuajo: la actividad genética y la síntesis de las proteínas disminuyen de la cabeza (ceph.) hacia la cola (caud.), y de la espalda (D) al vientre.

D. La flecha indica la localización del islote sanguíneo: este territorio es el único que puede dar nacimiento a glóbulos rojos y sintetizar hemoglobina. Si se extrae quirúrgicamente, el embrión está condenado a morir de anemia.


Aristóteles había descubierto los gradientes morfogenéticos

Antes de examinar las diversas teorías que han sido propuestas para intentar explicar este enigma, conviene situarse durante unos instantes en una perspectiva histórica, y decir después algunas palabras respecto al tema de la evolución de la embriología. En efecto, el material ideal para el estudio de la diferenciación celular será siempre el embrión en vía de desarrollo.

Es probable que, desde el momento lejano en que el hombre puso huevos de gallina en incubadoras artificiales (y esto nos remonta a varios millares de años), se le ocurriese romper, de vez en cuando, la cáscara de un huevo y observar el espectáculo sorprendente de la transformación del huevo en pollito. Parece ser que Aristóteles nos dejó la primera descripción escrita del desarrollo de un huevo de gallina y observó un hecho importante: la cabeza del embrión se desarrolla más deprisa que su cola. Aristóteles había descubierto los gradientes morfogenéticos, es decir, el hecho de que la capacidad ("potencialidad") de desarrollo decrece yendo de la cabeza hacia la cola (fig. 3). Sabemos ahora que las potencialidades morfogenéticas disminuyen también yendo del dorso hacia el vientre. La figura 3D representa, de manera esquemática, el doble gradiente (cefalocaudal y dorsoventral) que cabe apreciar en un joven renacuajo; se ha representado, sobre la misma figura, la región localizada, llamada islote sanguíneo, que da nacimiento a los glóbulos rojos y en donde tiene lugar la síntesis de la hemoglobina.

Aristóteles trabajó, sin saberlo, en embriología descriptiva, cuando observaba el desarrollo del huevo de gallina. Esta ciencia continúa progresando, gracias al empleo de medios ópticos (el microscopio electrónico, en particular) cada vez más perfeccionados. Pero la simple descripción de los hechos no puede bastar para satisfacer la curiosidad humana: a principios de nuestro siglo se desarrolló la embriología experimental (que a mi padre, Albert Brachet, le gustaba llamar embrio­logía "causal"): delicadas intervenciones quirúrgicas han permitido establecer con precisión el mapa de los esbozos (fig. 4), es decir, la topografía de los territorios que dan ulteriormente origen a los diversos órganos de la larva y del adulto; estos mapas pueden ser trazados en una fase muy poco avanzada del desarrollo, mientras que el embrión está aún completamente indiferenciado. Otras experiencias han demostrado que algunos huevos están formados por un mosaico de territorios, llamados localizaciones germinales: su destrucción no puede ser totalmente reparada y el embrión

Figura 4. Mapa de los esbozos en un huevo de rana. Las letras U y V indican, respectivamente, el dorso y el vientre del futuro embrión El territorio n da origen al sistema nervioso, después de una interacción (inducción) con el territorio subyacente c; éste dará origen a un órgano típicamente embrionario, que desaparecerá en el adulto (la chorda dorsal). Este territorio c es el que contiene el creciente gris, que indica, desde la fecundación del huevo, el dorso del futuro embrión. El territorio ec dará origen a la piel; md se diferenciará en músculos; mc corresponde al futuro islote sanguíneo de la figura 2B, que dará origen a los glóbulos rojos; en formará el intestino, el hígado, el páncreas, etc. El huevo, en este estado, está aún totalmente indiferenciado; pero la embriología experimental permite saber, con precisión, en lo que se convertirá cada uno de los territorios que lo componen.

Figura 5A. Desarrollo en mosaico:

I. Cuando el huevo de un gusano o de un molusco va a dividirse en dos, toma momentáneamente la forma de un trébol, a causa de la presencia de un lóbulo polar (1p).

2. Si se elimina el lóbulo polar, que no contiene núcleo, se obtiene la formación (le una nueva larva anormal. F1 citoplasma del lóbulo polar constituye una localización germinal, indispensable para la producción de un embrión normal. Su ablación no puede ser corregida por el resto del embrión.

Figura 5B. Por el contrario, la regulación embrionaria permite a medio huevo de erizo de mar dar origen a una larva normal.

1. En el transcurso del desarrollo normal, cl huevo se divide en dos blastómeros (bl y forma enseguida una larva característica, la pluteus (pl.

2. Si se separan los dos primeros blastómeros, cada uno de ellos da origen a una pluteus completa (experiencias de H. Driesch).


operado queda fatalmente imperfecto y anormal (fig. 5A). En otras especies, por el contrario, las lesiones sufridas por el huevo en una fase temprana son perfectamente reparadas y se obtiene, gracias a un fenómeno de regulación, un embrión normal. La figura 5B demuestra un caso extremo de regulación, descubierto desde 1900 por H. Driesch: en el transcurso de su desarrollo normal, el huevo de erizo de mar fecundado se divide en dos células llamadas blastómeros; cada blastómero da origen a medio erizo de mar. Pero si se separan los dos primeros blastómeros uno de otro, se constata que cada uno de ellos da origen a un erizo de mar completo.

Más allá del neo-vitalismo de Driesch nace la embriología molecular

Driesch no propuso más que una explicación filosófica de su experiencia: si "la parte da el todo" (es decir, si un solo blastómero da origen a un embrión completo), es porque el huevo contendría una "entelequia"; esta fuerza vital, cuyo nombre se tomó de la filosofía aristotélica, jugará, según las circunstancias, el papel de un freno o de un acelerador. Por definición, la entelequia no tendría localización espacial ni sería accesible a la experimentación.

La embriología química o molecular no puede satisfacerse con el neo-vitalismo de Driesch, ya que intenta precisar la naturaleza física y química de las localizaciones germinales y de los gradientes morfo-genéticos. Se esfuerza por establecer las bases moleculares de la regulación y de la diferenciación embrionarias. Yo no creo que haya lugar para establecer una distinción estricta entre embriología química y embriología molecular: empecé mi carrera científica hace cuarenta y cinco años, en la vía de la embriología química, es decir, del análisis bioquímico del desarrollo embrionario. El azar ha hecho que me haya interesado, desde este momento, en los ácidos nucleicos: como la embriología molecular se ocupa, ante todo, del papel de los ácidos nucleicos y de las proteínas en el desarrollo, yo he trabajado en embriología molecular sin saberlo durante casi toda mi vida (como el señor Jordán hacía prosa ignorándolo totalmente). La embriología molecular de hoy se distingue, sin embargo, de la embriología química de mi juventud por una diferencia importante: ha heredado el modo de pensar y las técnicas de la biología molecular. Se preocupa, ante todo, de las interacciones que se producen a cada instante entre los genes nucleares y el citoplasma: son en efecto estas interacciones nucleocitoplásmicas las que dirigen la diferenciación embrionaria.

Después de estas observaciones de orden general, es importante examinar rápidamente las principales teorías que han sido propuestas para intentar explicar la diferenciación celular.

2. Las teorías de diferenciación embrionaria

Hemos visto que la embriología experimental ha demostrado claramente la importancia del papel que juega el citoplasma en el transcurso de las primeras etapas del desarrollo embrionario. Pero otras experiencias demuestran, de manera no menos perentoria, la necesidad de una intervención del núcleo para que el desarrollo se continue más allá del período inicial de segmentación del huevo: en ausencia completa del núcleo, el huevo puede, en el mejor de los casos, segmentarse varias veces anárquicamente. Si se irradia el huevo y el espermatozoide con rayos X, diversos blastómeros procedentes del huevo fecundado poseerán un número variable de cromosomas: esta condición aneuploide es muy letal; el huevo muere, en general, en el momento en que alcanza el estado ~blástula, que marca el final del período de segmentación del huevo ! fecundado. En esta fase, las célalas no presentan aún ninguna diferenciación visible al microscopio. Es evidente que ninguna teoría puede dar cuenta de los hechos si no tiene en consideración las interacciones que se producen entre el núcleo y el citoplasma, sobre todo en el transcurso de las primeras etapas del desarrollo embrionario.

La teoría cromosómica de Roux y Weismann...

Desde una perspectiva histórica se puede decir que la primera teoría que haya intentado explicar la diferenciación embrionaria es la que propusieron Weismann y Roux. Wilhelm Roux y Albert Brachet demostraron la importancia para la morfogénesis de los huevos de rana, de un territorio (el creciente o semiluna gris) que se sitúa entre los dos polos del huevo (el polo animal pigmentado y el polo vegetativo blanco). Esta zona de transición, marcada c en la figura 4, corresponde al futuro lado dorsal del embrión; si se destruye por punción el creciente gris de un huevo recién fecundado y aún sin dividir, el desarrollo de los órganos axiales del embrión (sistema nervioso, chorda dorsal) es fortísimamente inhibido. Las punciones efectuadas en otras regiones del huevo producen efectos mucho menores. Experiencias más recientes de Curtis han demostrado que la región del huevo fecundado que es realmente importante es el córtex del creciente gris, es decir, la delgada capa de citoplasma pigmentado, de 1 a 2 micras de espesor, que se encuentra inmediatamente por debajo de la membrana celular: la eliminación del córtex dorsal del huevo fecundado impide todo desarrollo ulterior.

Estas experiencias parecen demostrar, una vez más, la importancia del papel que juega el citoplasma en el desarrollo ulterior del huevo. No obstante, la teoría propuesta por Roux y Weismann, en 1885, para explicar la diferenciación embrionaria es una teoría cromosómica: los cromosomas serían portadores de determinantes hereditarios (diríamos ahora genes) distintos para la diferenciación del embrión en una mitad dorsal (sistema nervioso, chorda, músculos) y una mitad ventral (intestino, glóbulos rojos). Las primeras mitosis de segmentación que dividen el huevo fecundado en blastómeros dorsales y ventrales serían desiguales desde el punto de vista genético: los núcleos dorsales y ventrales, desde el principio de la segmentación del huevo, serían, pues, genéticamente diferentes.

La experiencia ha permitido eliminar la teoría de Weismann-Roux. En efecto, ha sido posible destruir electivamente uno de los dos primeros núcleos del huevo en segmentación: no obstante, el desarrollo, tanto en los insectos (Seidel) como en los anfibios (Spemann), ha sido normal. Los descendientes del núcleo "ventral" que han colonizado el citoplasma dorsal se han comportado exactamente como lo habría hecho un núcleo "dorsal". Estas experiencias, que son de una importancia fundamental, demuestran la equipotencialidad de los núcleos en el transcurso de la segmentación del huevo: en esta fase precoz del desarrollo, todos los núcleos son idénticos y, por consiguiente, intercambiables.

...no tenía en cuenta las interacciones del núcleo y del citoplasma

Es a un célebre genetista americano, T.H. Morgan que fue también un notable embriólogo) al que se debe el haber propuesto, en 1934, una teoría de la diferenciación que es valedera aún hoy a grandes rasgos y que tiene en cuenta las interacciones nucleocitoplásmicas que se producen en el transcurso del desarrollo. Morgan, partiendo de dos hechos que nos son ya conocidos (la heterogeneidad del citoplasma del huevo y la equipotencialidad de los núcleos durante la segmentación del huevo), ha propuesto que la actividad de los genes sería modificada por el citoplasma circundante. Como muestra la figura 3A, núcleos idénticos serían distribuidos en un citoplasma heterogéneo; bajo la influencia de este citoplasma, ciertos núcleos se modificarían, de tal manera que algunos de sus genes se harían activos; su activación provocaría modificaciones del citoplasma circundan­te que se haría entonces más heterogéneo aún. Este juego de interacciones mutuas entre las genes y el citoplasma conduciría finalmente a la diferenciación celular.

Basta con poco para modernizar esta teoría y situarla en el cuadro de la biología molecular: diríamos hoy que los núcleos, durante el período inicial de segmentación, están "reprimidos" y, por consiguiente, incapaces de sintetizar las moléculas de ARN mensajero (mARN) necesarias para que el citoplasma sintetice nuevas especies de proteínas. Después de la segmentación (es decir en la gastrulación), los núcleos de las regiones más activas del embrión serían "desrreprimidos": sus genes dirigirían la síntesis de nuevos m-ARN y, por consiguiente, nuevas proteínas.

Para comprender la diferenciación, el trasplante de núcleos...

Veremos más adelante que la embriología molecular ha demostrado que va bien así. Pero debemos, antes, plantearnos una pregunta cuya importancia fundamental no había pasado inadvertida a la sagacidad de Morgan: ¿en qué momento los núcleos dejan de ser equipotenciales? En otros términos, ¿en qué fase del desarrollo se diferencian los núcleos?

La pregunta ha sido atacada de manera directa por Briggs y King, que tuvieron éxito por primera vez, en 1952, en los trasplantes nucleares: la experiencia consiste en inyectar el núcleo de una célula elegida por el experimentador en el citoplasma de un huevo virgen del que se ha quitado el núcleo: si el núcleo trasplantado ha conservado las mismas potenciali­dades que el del huevo fecundado, debería obtenerse un desarrollo completo, llegando hasta el adulto. Esto es lo que sucede cuando se implanta el núcleo del huevo en vía de segmentación (blástula) en un huevo virgen anucleado. Pero la interpretación de los resultados se hace más delicada a continuación, porque numerosos núcleos trasplantados presentan anomalías cromosómicas cuando se multiplican en el citoplasma de la célula virgen anucleada; estas anomalías son más frecuentes -provocando la detención del desarrollo debido a la letalidad- cuanto más edad tienen los embriones cuyos núcleos son trasplantados. En resumen, el envejecimiento de los núcleos, que se manifiesta por la incapacidad de multiplicarse normalmente en el jovencísimo citoplasma de un huevo virgen, se manifiesta ya en la fase blástula, es decir, menos de un día después de la fecundación del huevo. Este hecho complica mucho, evidentemente, la interpretación de las experiencias de trasplante nuclear. Felizmente, Gurdon, refiriéndose a un material biológico particularmente favorable (el Xenopus sapo de origen sudafricano) y utilizando algunos artificios técnicos, que no podemos describir aquí, ha, llegado a aportar recientemente una respuesta clara a las preguntas que se planteaba ya Morgan: ha trasplantado en huevos vírgenes anucleados núcleos procedentes de células adultas perfectamente diferenciadas (células de hígado, riñón, pulmón, etc.) y ha obtenido en un débil porcentaje de casos la formación de renacuajos prácticamente normales. Estos renacuajos eran, naturalmente, el asiento de una diferenciación celular muy prolongada y poseían, pues, un sistema nervioso, músculos y un corazón capaces de contraerse, riñones un tubo digestivo, etc. Esta experiencia tan importante demuestra que los núcleos del adulto pueden sustituirse completamente en el núcleo del huevo recién fecundado; han conservado intacta toda la información genética contenida en el núcleo del huevo y en el del espermatozoide. Los genes presentes en el núcleo de la célula adulta diferenciada son, pues, idénticos a los del huevo fecundado y pueden expresarse normalmente cuando se les coloca en un medio favorable (el citoplasma de un huevo virgen anucleado). En otros términos, los núcleos no se diferencian de manera irreversible en el transcurso de la vida del individuo.

... y el estudio del funcionamiento genético de las bacterias se completa

Si volvemos a la teoría de Morgan, vemos que las experiencias de Gurdon demuestran que la heterogeneidad del citoplasma no puede afectar a la naturaleza misma de los genes; puede, por el contrario, afectar a su expresión, es decir, a su funcionamiento. La naturaleza de los factores que regulan la actividad de los genes, poniendo en marcha o deteniendo su funcionamiento, es la llave del problema de la diferenciación celular.

Gracias sobre todo a Jacob y Monod, sabemos muchas cosas sobre el control de la actividad genética en las bacterias. No se puede dejar de admirar la manera exacta y compleja con la que se efectúa este control en un organismo tan "simple" como el bacteriófago X . A1 reflexionar sobre la existencia de delicados mecanismos de regulación tanto negativos (bloqueo de la actividad genética por un represor específico) como positivos en el caso de un bacteriófago, uno no puede impedir el preguntarse, con inquietud, hasta dónde puede llegar la complejidad de estos mecanismos en el caso de un huevo en vía de desarrollo. Si la teoría de Morgan modernizada (activación selectiva de ciertos genes -por ejemplo, los de la hemoglobina en el momento en que los glóbulos rojos van a diferenciarse en unas regiones bien definidas del embrión y en fases concretas) queda como guía indispensable para el embriólogo, está claro que no podrá satisfacernos en tanto no conozcamos mecanismos moleculares que permitan la activación de un gen y la inactivación de otros.

Se han hecho esfuerzos en el campo teórico para explicar la diferenciación celular partiendo del modelo establecido por Jacob y Monod respecto a la regulación de la actividad genética en las bacterias. Jacob ha demostrado, por otra parte, que este modela, mediante algunos arreglos, puede servir de base a una teoría genética de la diferenciación celular. Un modelo mucho más complejo, que no nos es posible presentar aquí, ha sido propuesto después por Britten y Davidson. No deja de tener interés el subrayar que estos autores han modificado recientemente su modelo con el fin de tener en cuenta la heterogeneidad del citoplasma, factor que los genetistas tienden generalmente a descuidar. Desgraciada­mente, teorías tan complejas como la de Britten y Davidson no se harán accesibles a una verificación experimental más que cuando la genética de los eucariontes pueda rivalizar con la bacteria, de lo que aún estamos muy lejos.

Algunas teorías mal encaminadas

Algunos investigadores, principalmente Scarano, han intentado explicar la diferenciación celular suponiendo que las moléculas de ADN soportarían modificaciones químicas (metilaciones, por ejemplo) en el transcurso del desarrollo embrionario. Tal hipótesis es difícilmente compa­tible con los resultados experimentales de trasplantes nucleares de Gurdon que acaban de ser discutidas. Encuadra mal también con numerosos casos conocidos de "diferenciación", en donde se ve a las células, en ciertas condiciones de cultivo, volver a un estado menos diferenciado (por ejemplo, pérdida del pigmento por parte de células pigmentadas).

Otra teoría original, que tendremos ocasión de discutir más adelante, es la de una amplificación selectiva de un gen: ciertos genes, por ejemplo, los que dirigen la síntesis de la hemoglobina, se replicarían independiente­mente del resto del genoma en las células madres de los glóbulos rojos. Los genes de la hemoglobina, al no existir en número suficiente más que en estas células, harían de ellas las únicas capaces de sintetizar hemoglobina.

Por último, algunas teorías -a decir verdad poco extendidas en este momento-- ponen el acento sobre el citoplasma más bien que sobre el núcleo para dar cuenta de la diferenciación celular. Imaginan la existencia en el citoplasma de partículas nucleoproteicas capaces, como los virus, de reproducirse de manera autónoma: son los hipotéticos "plasmagenes" Existe, efectivamente, cierto número de partículas citoplásmicas capaces de replicarse de manera autónoma: son los centríolos de las células en vía de división, los cinetosomas de los cilios y de los flagelos, las mitocondrias y los cloroplastos de las plantas verdes. Como las mitocondrias y los cloroplastos contienen ADN y pueden ser el emplazamiento de mutaciones, podrían, en teoría, jugar un papel en la diferenciación celular. De hecho, se ha demostrado que las mitocondrias son necesarias en la diferenciación muscular en larvas jóvenes de tunicados. Pero la información genética presente en el ADN de las mitocondrias, principalmente en el caso de los huevos, es demasiado débil para poder atribuirles una larga autonomía frente a los genes nucleares. Es probable que la intervención de las mitocondrias en la diferenciación embrionaria de los tunicados se limite a la producción de la energía requerida para la síntesis de macromoléculas específicas.

Recientemente, Bell ha afirmado la presencia de partículas que contenían ADN susceptibles de replicarse de manera autónoma en el citoplasma; para este investigador, estos I-somas (I = información) serían responsables de la diferenciación celular. Pero hay qué admitir que las pruebas experimentales de su existencia no son aún convincentes.

Conviene, por último, decir algunas palabras sobre las ideas desarro­lladas por Curtis: como ya se ha visto, este investigador ha demostrado que el córtex del creciente gris es responsable de las propiedades morfogenéticas de este territorio. En una segunda serie de experiencias, Curtis produjo ligeras heridas en el córtex dorsal: algunos huevos así lesionados se desarrollaron normalmente y de ellos nacieron adultos. Curtis tuvo la curiosidad de cruzar estos adultos con individuos normales, comprobando que los embriones procedentes del cruce entre un macho normal y una hembra nacida de un huevo cuyo creciente gris había sido lesionado son letales: la mayor parte de ellos mueren en una fase precoz del desarrollo y muy pocos consiguen el estado adulto. El cruce recíproco (macho nacido de un huevo cuyo creciente gris había sido herido + hembra normal) da, por el contrario, una descendencia normal. Curtis concluyó de esto que el córtex dorsal poseería su propia herencia, debido a la presencia de partículas capaces de una réplica autónoma. Pero las experiencias de control que hemos efectuado recientemente muestran que esta conclusión sólo puede ser aceptada con la mayor prudencia: hemos constatado en efecto que, contrariamente a lo que se pensaba, una lesión discreta del cór­tex del huevo no afecta únicamente al citoplasma. Tales lesiones alteran también las divisiones celulares (mitosis) que caracterizan la segmentación del huevo; de esto resulta la aneuploidia, que es mucho más frecuente después de las lesiones del córtex dorsal que tras las punciones del córtex ventral. Si las lesiones superficiales del huevo recién fecundado repercuten en los cromosomas, no es sorprendente que el individuo nacido de los huevos cuyo córtex había sido ligeramente lesionado presente anomalías del desarrollo.

Después de este examen rápido de las principales teorías de la diferenciación celular, es importante conocer los experimentos básicos de la embriología molecular. En este sentido, seguiremos el único camino que parece lógico a un embriólogo: partir del oocito ovárico y llegar a las células diferenciadas del embrión avanzado o del adulto.

3. La creación de un nuevo ser

La formación de las células sexuales, los gametos, constituye la fase preparatoria para la morfogénesis de un embrión. No es necesario detenerse mucho en el espermatozoide (fig. 6), pues su papel en el desarrollo embrionario es totalmente secundario con relación al del huevo; se sabe, después de los experimentos de Bataillon y de Loeb, que puede obtenerse un desarrollo normal y completo por partenogénesis.

Al principio de la formación del huevo...

La formación de los huevos, u oogénesis, se caracteriza sobre todo por el crecimiento de las células reproductoras (oocitos) en el ovario de la hembra. Este crecimiento, que puede tomar proporciones gigantescas (un huevo de avestruz es una célula gigante), es debido a la acumulación de un material de reserva, el vitelo. Este último está formado por proteínas, concentradas en gránulos microscópicamente visibles, las plaquetas vitelinas. La proteína principal del vitelo, la fosvitina, contiene fósforo y se parece a la caseína de la leche; en efecto, el vitelo y la leche de los mamíferos realizan la misma función: los dos sirven para cubrir las necesidades nutritivas del joven organismo en vía de crecimiento. Las plaquetas vitelinas de los oocitos de los batracios contienen, además de un grueso cristal central de fosfoproteína, pequeñas cantidades de ácidos nucleicos ADN y ARN y enzimas hidrolíticas, capaces de degradar la fosfoproteína, haciéndola utilizable en el transcurso del desarrollo del embrión. Las fosfoproteínas del vitelo no son sintetizadas por el oocito mismo:. son producidas en el hígado, tras una estimulación por las hormonas femeninas, después vertidas en la sangre circulante. Son enseguida recuperadas por el oocito, cuya membrana, que está muy

Figura 6. Representación esquemática de un espermatozoide: el acrosoma a contiene las enzimas necesarias para disolver las membranas que protegen el huevo virgen. El núcleo n contiene ADN bajo una forma compacta que le protege contra los azares de la vida-, el DNA encierra en sí todos los caracteres hereditarios paternos. El espermatozoide es móvil gracias a los movimientos de su flagelo f. La energía necesaria para que el flagelo pueda moverse proviene de las mitocondrias m. En resumidas cuentas, el espermatozoide es una máquina altamente especializada que sirve para inyectar el ADN (los genes) paterno en el huevo.


especializada, deja penetrar en el oocito las moléculas proteicas intactas. Es probable que el ADN vitelino, que sirve sin duda de reserva para la síntesis de los ADN nucleares en el transcurso del desarrollo, sea también él de origen hepático.

Pero el oocito no se limita a acumular productos de reserva recibidos del exterior: él sintetiza también, con gran actividad, sus propios ácidos nucleicos y proteínas (principalmente un gran número de enzimas). La precisión del oocito va hasta sintetizar enzimas que le son probablemente inútiles, pero que le servirán cuando, algunos días después de la fecundación, su sustrato haya hecho aparición. El oocito sintetiza toda la maquinaria que permitirá más tarde al embrión sintetizar sus propias proteínas: en particular el oocito fabrica un número prodigioso de ribosomas y un amplio abanico de ARN mensajeros.

El estudio de la síntesis de los ácidos ribonucleicos ribosómicos (r-ARN) en el transcurso de la oogénesis del Xenopus constituye uno de

Figura 7. Los núcleos de los oocitos muy jóvenes de Xenopus contienen dos cromatinas distintas: una "cofia" condensada (indicada por flechas) y los cromo­somas. La cofia contiene el ADN ribosómico (r-ADN), que dirigirá la síntesis de los ARN ribosómicos (r-ARN). En la fase representada por la figura 7 se produce una síntesis intensa del r-ADN en la cofia: resulta de ello una amplificación gigantesca de genes ribosómicos, que serán cerca de un millón de ejemplares en el oocito de más edad. Esta amplificación permitirá al oocito sintetizar los innumerables ribosomas que son indispensables para la síntesis de sus proteínas en el transcurso del desarrollo.


los capítulos más apasionantes de la embriología molecular. En las primerísimas etapas del oocito, bastante antes del principio de la vitelogénesis, son sintetizados en el núcleo dos tipos diferentes de ADN: el ADN cromosómico y el ADN ribosómico (r-ADN). Este último (que es químicamente diferente del ADN de los cromosomas y que puede ser considerado como un ADN extra-cromosómico) dirige la formación de los nucléolos en el núcleo del oocito y la producción de los innumerables ribosomas que llenan su citoplasma. El r-ADN corresponde, en resumen, a los genes ribosómicos; éstos existen en un ni mero enorme da copias en el oocito, gracias a un proceso de amplificación genética que se produce al principio mismo de la oogénesis. La figura 7 muestra que, en estos jovencísimos oocitos de Xenopus una parte del ADN forma una "cofia" que sobrepasa los cromosomas. Esta cofia corresponde a los genes ribosómicos (al r-ADN) en vía de replicación: esta replicación es extremadamente intensa, de tal manera que en el oocito existen cerca de un millón de copias de genes ribosómicos (por lo menos los que codifican para ¡os r-ARN macromoleculares 28S y 18S). Estos genes ribosómicos, después que la cofia se dispersa, se vuelven a encontrar en los 1.500

Figura 8. El r-ADN, cuya síntesis se ha visto en la figura 7, se reparte entre 1.000 ó 1.500 nucléolos en el transcurso de la oogénesis; forma ahí los organizadores nucleolares. La figura 8 muestra el extraordinario aspecto de estos organizadores nucleolares, tal como Miller ha llegado a observarlo al microscopio electrónico. Las cadenas de ARN ribosómico han sido sorprendidas en vía de síntesis: se presentan como las barbas de una pluma de pájaro, agarradas a un eje formado por ADN. Algunas regiones del ADN ("espaciadores") son inactivas y no sintetizan ARN. Las regiones activas e inactivas se siguen de una manera sorprendentemente regular.


nucléolos del oocito, donde forman los organizadores nucleolares. La figura 8 muestra el aspecto de un organizador nucleolar tal como se puede ver al microscopio electrónico: las regiones que sintetizan los r-ARN se presentan bajo una forma que recuerda a las barbas de una pluma de pájaro; están separadas por regiones mudas, llamadas "espaciadores".

... la maquinaria que permitirá al embrión sintetizar sus propias proteínas se pone en su sitio...

Uno esperaría ver, tras esta prodigiosa amplificación de genes ribosómicos, al oocito puesto inmediatamente a fabricar ribosomas. Sin embargo, no hace nada de eso: el joven oocito de Xenopus (de 400 a 200 pm de diámetro) no sintetiza más que los ARN de ligero peso molecular. Los innumerables genes ribosómicos están, pues, completamente reprimidos, no funcionales, en esta fase. Esta represión llega a su fin en el momento en que las primeras plaquetas vitelinas hacen su aparición en el citoplasma. En tal punto la producción de ribosomas se hace en extremo intensa hasta el momento en el que (habiendo alcanzado el oocito su talla máxima) la actividad de los genes ribosómicos sufrirá una nueva represión.

La producción de ribosomas no se hace de manera homogénea en el huevo: son mucho más abundantes en uno de los polos (el polo animal) del oocito que en el polo opuesto (llamado vegetativo), donde las plaquetas vitelinas son más numerosas y más voluminosas (fig. 3A). Este gradiente de polaridad es muy importante: el polo animal se convertirá en la cabeza del embrión y el polo vegetativo en su cola. Sin esta polaridad, el embrión no tendría "ni cola, ni cabeza". Desgraciadamente, ignoramos todos los factores que controlan el establecimiento del gradiente animal-vegetativo de polaridad.

Durante el gran crecimiento del oocito, los cromosomas toman un aspecto muy particular (fig. 9): las larguísimas fibras de ADN que los constituyen se apelotonan para formar millares de anillos, de tal forma que el cromosoma parece una pluma o un escobillón. Los cromosomas "plumosos" son la base de una síntesis importante de ARN mensajeros (mARN) de naturaleza muy variada. No obstante, esta síntesis es insuficiente para que todos los ribosomas puedan enlazarse con las moléculas de m-ARN con el fin de formar polisomas activos en la síntesis de las proteínas: de hecho, el 90% de los ribosomas del oocito son libres y disponibles para la formación de ribosomas. Este punto ha sido demostrado

Figura 9. Cromosomas "plumosos" de un oocito de tritón, fotografiados por H.G. Callan. Los cromosomas homólogos están apareados y unidos por un "quiasma". Numerosos anillos se desprenden del eje de los cromosomas: al nivel de estos anillos se sintetizan los ARN mensajeros. Cada anillo es una manifestación microscópica­rnente visible de la actividad de un gen.


recientemente, de manera muy elegante, por Gurdon, quien inyectó en los oocitos de Xenopus un m-ARN específico bajo forma purificada (m-ARN de- la hemoglobina de conejo); tras la inyección de dicho mensajero, los oocitos sintetizaron durante varios días cantidades crecientes ,le una proteína que les es totalmente extraña: hemoglobina de conejo.

Esta síntesis masiva de ribosomas en el tanscurso de la oogénesis permite al oocito acumular una reserva de ribosomas suficiente para permitirle alcanzar la fase en la que el renacuajo comienza a alimentarse; lo sabemos porque existe un mutante de Xenopus (llamado nu-o) que ha perdido sus organizadores nucleolares después de una deleción, y, al no poseer r-ADN, no forma nucléolos y es incapaz de sintetizar ribosomas; sobrevive, no obstante, hasta una fase larvaria bastante avanzada.

... después que el oocito experimente su maduración hará lo que un huevo virgen inerte

Cuando el oocito ha alcanzado su talla final, permanece metabólicamente inerte hasta el momento en el que, bajo la influencia de una estimulación hormonal, experimenta su maduración (fig. 10): la membrana nuclear se rompe, los nucléolos desaparecen, sus organizadores nucleolares

Figura 10. Bajo la influencia de una estimulación hormonal, el oocito consigue su maduración.

1. Aspecto de un oocito de rana que no ha sido tratado por la hormona: se ven unos 1.000 nucléolos que contienen el voluminoso núcleo (vesícula germinativa).

2. Oocito tratado durante algunas horas con progesterona: los nucléolos son menos numerosos y más voluminosos; los ribosomas se han acumulado por debajo de la membrana nuclear. Más tarde, la vesícula germinativa desaparecerá completamente. Los cromosomas se condensarán y se reagruparán en el polo animal, agarrados a un huso de maduración. La mezcla del jugo nuclear, y del citoplasma, que caracteriza la maduración, es indispensable para que el huevo fecundado pueda dividirse.


son eliminados en el citoplasma; los cromosomas se condensan, emigran hacia el polo animal y el huevo elimina, en más o menos breve plazo, sus dos glóbulos polares: el huevo virgen es una célula haploide y llega a ser, como el oocito maduro, una célula metabólicamente inerte.

Pero el período de maduración en sí mismo se caracteriza por una gran síntesis proteica, inducida por la hormona femenina (progesterona). Cosa curiosa, esta síntesis de proteínas se produce perfectamente en ausencia de toda síntesis de ARN. 5i se quita el núcleo del oocito y se trata éste enseguida con progesterona, la síntesis de proteínas inducida por la hormona es perfectamente normal; esta síntesis es, pues, dirigida por los mARN preexistentes, sintetizados por los cromosomas plumosos. El papel de las proteínas sintetizadas durante la maduración aún no está bien establecido: sabemos sólo que estas proteínas migran en los núcleos en el transcurso de la segmentación del huevo, y se puede suponer que intervienen en la regulación de la actividad genética. Este período del desarrollo, como lo veremos, se caracteriza sobre todo por la multiplica­ción de los núcleos, lo que implica una importante síntesis de ADN. Es muy probable que las enzimas requeridas para esta síntesis formen parte de las proteínas sintetizadas durante la maduración: en efecto, se ha demostrado que, si se inyecta un ADN de cualquier origen en un oocito antes de la maduración, no se replica; pero si se inyectan estos mismos ADN en el transcurso de la maduración (o después de ésta), sus moléculas son replicadas.

Otras experiencias, debidas a Gurdon, confirman la idea de que la maduración es una etapa en la que las actividades sintéticas del oocito se modifican cualitativamente: mientras que el oocito está orientado hacia la síntesis de ARN, el huevo en vía de maduración se prepara para la síntesis del ADN. Sí se inyectan núcleos de órganos adultos (hígado, cerebro) que no sintetizan normalmente ADN en un oocito en vía de maduración, se observa hinchazón de los núcleos (debida a la penetración de proteínas citoplásmicas), detención de la síntesis de los ARN y, por último, la puesta en marcha de una síntesis de ADN; ésta puede conducir a la entrada en mitosis de los núcleos inyectados. Es, pues, del estado del citoplasma del huevo, de lo que depende la elección entre las dos actividades principales del núcleo: síntesis de ARN o replicación del ADN.

Sobreviene la fecundación

La función del huevo y del espermatozoide tiene numerosas consecuencias importantes desde el punto de vista biológico: el número de cromosomas se hace de nuevo diploide; el huevo fecundado (cigoto) posee a la vez los caracteres hereditarios paterno y maternos; el sexo del futuro adulto se establece a menudo desde este momento.

Desde el punto de vista morfológico, el cambio más chocante es el levantamiento de una membrana de fecundación (fig. 11) y la fusión de los dos pronúcleos (núcleos haploides del huevo y del espermatozoide). El levantamiento de la membrana que atenazaba al huevo le permite dar vueltas libremente bajo la influencia de la gravedad: el pesado polo vegetativo se orienta hacia abajo, el polo animal hacia arriba. Es esta rotación de orientación, como ha demostrado Ancel y Vintemberger, lo que provoca la aparición del creciente gris (fig. 4) en los anfibios. Desde este momento, las coordenadas de( embrión y del adulto están fijadas: el polo animal marca la cabeza y el creciente gris, el dorso: el plano que corta el creciente gris en dos mitades iguales constituye el plano de simetría bilateral, que separa las mitades derecha e izquierda del adulto. Todos estos cambios, en extremo importantes para la continuación del desarrollo, se producen en el citoplasma y no existe ninguna razón para pensar que estén bajo cualquier control genético. Además, el núcleo del huevo fecundado no sintetiza ARN en cantidades mensurables; por el contrario, se produce casi inmediatamente (en algunos minutos) una replicación de su ADN hecha posible por las síntesis proteicas que hayan marcado la maduración.

En el caso de muchas especies animales, pero sobre todo del erizo de mar, la fecundación se acompaña con una intensa estimulación de la respiración celular y de la síntesis de las proteínas. Esta última no es debida a la producción de nuevas moléculas de m-ARN, sino al enlace de m-ARN preformado, de origen materno y acumulado en el citoplasma del huevo con los ribosomas que se han producido en masa durante la oogénesis. Parece que los ribosomas del huevo virgen de erizo de mar sean anormales: estarían recubiertos por un inhibidor de naturaleza proteica que les impediría combinarse con los m-ARN citoplásmicos. Una de las consecuencias importantes y precoces de la fecundación sería la destrucción de este inhibidor. El papel del núcleo y de los genes en esta estimulación inicial de la síntesis proteica parece nulo: la misma síntesis de proteínas se observa, en efecto, incluso en ausencia del núcleo celular.

Figura 11. La fecundación tiene numerosas consecuencias importantes que resultan, a más o menos largo plazo, de la penetración del núcleo del espermatozoide en el huevo. Sin embargo, la reacción inmediata más chocante afecta a la superficie del huevo durante la fecundación: se ve, a la izquierda, un esquema de la membrana y del córtex de un huevo de erizo de mar virgen y, a la derecha, las estructuras correspondientes en un huevo recientemente fecundado (según J. Runnström). El cambio más importante es el levantamiento de la membrana de fecundación, que permite al huevo orientarse siguiendo la gravedad (el polo animal mirará hacia arriba y el polo vegetativo hacia abajo). Esta rotación de orientación provoca, en el huevo de rana, la aparición del creciente gris (ver fig. 4) que marca el dorso del futuro embrión. La reacción del córtex del huevo puede también ser provocada por agentes químicos o físicos (activación partenogenética): señala el despertar del huevo virgen, que estaba inerte, tanto en lo que concierne al desarrollo embrionario como a 1a actividad bioquímica (estimulación de la respiración y de la síntesis de proteínas, especialmente).


El huevo fecundado empieza a dividirse: segmentación

A la fecundación del huevo siguen divisiones celulares repetidas: los blastómeros se hacen cada vez más pequeños hasta el momento en que se alcanza la fase de blástula. Este período del desarrollo se caracteriza por una replicación rapidísima del ADN, sin duda tan rápida como la de las bacterias. La síntesis de los ARN se limita a la producción de una pequeña cantidad de m-ARN; no hay formación de rARN durante la segmentación, salvo en los mamíferos en los que el almacenamiento de ribosomas presente en el huevo virgen es mucho menos importante que en otra parte. La ausencia de nucléolos hasta la fase blástula avanzada va a la par de la represión de los genes ribosómicos. En cuanto a los mARN producidos durante la segmentación, no juegan por supuesto un papel importante durante esta fase del desarrollo. En efecto, se puede suprimir completa­mente su síntesis tratando los huevos fecundados con actinomicina: el desarrollo necesario es normal hasta el fin de la segmentación; pero la etapa siguiente del desarrollo, la gastrulación, no se inicia. Hay que deducir que los mensajeros sintetizados durante la segmentación no son necesarios hasta el momento de la gastrulación. Por el contrario, un tratamiento de los huevos por inhibidores de la síntesis proteica bloquea casi inmediata­mente la segmentación; ésta requiere, pues, la síntesis de nuevas proteínas (en particular la de la tubulina que entra en la composición del huso y de los ásteres); pero no necesita la síntesis de ARN.

Estos datos bioquímicos encuadran perfectamente con las experien­cias embriológicas que muestran que, durante la segmentación, la importancia del citoplasma (donde se hace la síntesis de las proteínas) es superior a la del núcleo (base de la síntesis del ARN). En esta fase, la ' destrucción de localizaciones germinales citoplásrnicas y la punción del córtex del creciente gris ejercen efectos profundos sobre la diferenciación del embrión. El material gelatinoso extracelular que une los blastómeros; (cemento intercelular) tiene también su importancia para la morfogénesis:

si se le añade a los huevos fecundados, su desarrollo se bloquea en la fase blástula. Podría suceder que este material interviniera en la experiencia de Driesch sobre la regulación embrionaria en el erizo de mar (ver más arriba): es lógico que los blastómeros separados, libres del cemento intercelular, tengan un desarrollo superior al que habrían tenido in situ, si este cemento ejerce un efecto inhibidor sobre el desarrollo.

La formación de tres capas celulares y la inducción del sistema nervioso siguen a la segmentación

La gastrulación es un proceso complejo que transforma la blástula en una larva aún indiferenciada (la gástrula), pero que posee ya las tres capas celulares (ectodermo, mesodermo y endodermo) de las que todos los órganos del adulto provienen. A grosso modo el ectodermo dará origen a la piel y al sistema nervioso; el cordomesodermo dará la chorda, los músculos, el esqueleto, los riñones, los glóbulos rojos; el intestino, el hígado y el páncreas se diferenciarán a expensas del endodermo.

Figura 12. Gastrulación. Corte a través de una joven gástrula (compárese con la figura 3, en la que el huevo se veía desde el exterior). El embrión contiene una cavidad central, el blastocelo (bl.). F1 territorio c (cordoblasto) es particularmente importante; corresponde al creciente gris del huevo fecundado y juega el papel de organizador: bajo su dirección, del territorio n nacerá el sistema nervioso. Como en la figura 3, ec corresponde al ectoblasto (que dará la piel), m al mesoblasto (futuros músculos, huesos, riñones, glóbulos rojos, etc.) y en al entoblasto (que proporcionará el intestino, el hígado, e( páncreas, etc.). La gastrulación es un período caracterizado por movimientos celulares intensivos, que permiten que se coloquen en lugar correcto los diversos presuntos territorios. También es el momento en el que los genes comienzan a volver a ser activos; esta actividad se traduce en la producción de especies nuevas de ARN mensajeros.

La gastrulación es un periodo en el que los movimientos celulares predominan sobre la actividad mitótica; estos movimientos se realizan gracias a la deformación de moléculas contráctiles muy parecidas a las que dan su contractilidad al corazón y a los músculos. La gastrulación marca también el principio de la desrepresión de los genes: en los núcleos se sintetizan nuevas especies de mensajeros, que no existían antes y que son indispensables en la gastrulación misma y para la continuación del desarrollo. Los genes ribosómicos salen, ellos también, de su letargo: los nucléolos hacen su aparición y se forman nuevos ribosomas.

A la gastrulación sigue la neurulación, que es dominada por la formación del sistema nervioso a expensas del ectodermo. Si se recortan fragmentos de ectodermo en la fase gástrula y se les cultiva in vitro, no forman más que una epidermis atípica y mal diferenciada. Si se añade a tales fragmentos ectodérmicos un poco de cordomesodermo, tomado igualmente de una gástrula, se transforman en sistema nervioso: esto resulta de una inducción, provocada por un factor presente en el cordomesodermo. Es muy probable que este factor sea una proteína específica, que se difunde del cordomesodermo hacia el ectodermo.

Otra proteína, que ha sido purificada, ejerce otro efecto totalmente distinto: transforma el ectodermo en mesodermo, de tal manera que los fragmentos ectodérmicos se diferencian en músculos, cartílago, etc. Estas proteínas preexisten ya en la gástrula y no sería sorprendente que estuviesen presentes ya en el oocito. No obstante, la inducción del sistema nervioso se acompaña también de una desrepresión de los genes, y los mensajeros que se sintetizan en este momento son necesarios para que las células ectodérmicas puedan reaccionar al estímulo inductor. Si la síntesis de los ARN está bloqueada por la actinomicina, no se observa ninguna disminución del poder inductor del cordomesodermo, que contiene ya las proteínas inductoras; pero la actinomicina anula, rápida y completamente, la capacidad de las células ectodérmicas para reaccionar al efecto inductor de las proteínas inductoras.

Producto de los genes del núcleo, la morfogénesis está modulada por el citoplasma

Hemos visto más arriba que se producen, durante todo el desarrollo embrionario, interacciones entre el núcleo y el citoplasma: si éste juega un papel predominante en el transcurso de las primeras etapas del desarrollo, l.. importancia de los genes se hace evidente desde la gastrulación y se afirma cada vez más cuando las células de los diversos tejidos se diferencian. Proteínas sintetizadas en el citoplasma ejercen sin lugar a duda un control sobre la actividad de los genes; al principio del desarrollo, la síntesis de estas proteínas está codificada por los mensajeros estables, preexistentes, de origen materno.

Cabe preguntarse si las partículas citoplásmicas que contienen ADN (mitocondrias, cloroplastos) juegan un papel, importante o menos, en la morfogénesis. Se puede responder a la pregunta utilizando un método radical: quitar el núcleo a un organismo unicelular y ver lo que ocurre.

Se han hecho experiencias de enucleación con huevos de diversas especies y con organismos unicelulares: nunca la ablación del núcleo viene seguida por la muerte rápida del citoplasma, ni siquiera por la pérdida inmediata de sus actividades. Nos limitaremos aquí a un breve resumen de nuestros conocimientos sobre los dos sistemas biológicos que han sido mejor estudiados: el huevo del erizo de mar y el alga unicelular gigante Acetabularia.

Pueden obtenerse con facilidad fragmentos anucleados centrifugando huevos vírgenes de erizo de mar. Estos fragmentos responden a los agentes partenogenéticos con segmentaciones repetidas. Pero del desarrollo nunca va más allá: la información que posee el citoplasma anucleado se limita por tanto a la posibilidad de algunas divisiones celulares, fatalmente abortivas. Los fragmentos anucleados contienen mensajeros de origen materno que les permiten responder a un estímulo partenogenético con una gran síntesis de proteínas. Entre estas proteínas está la tubulina, constitutiva de los ásteres que aseguran la segmentación del citoplasma anucleado. Pero los fragmentos anucleados también contienen numerosas mitocondrias, orgá­nulos responsables de las oxidaciones celulares; cada una de ellas posee ADN. Tras activación parte nogenética, este ADN se hace funcional y se sintetizan los ARN mitocondriales, Pero el hecho de que el desarrollo de los fragmentos anucleados activados esté, en suma, muy limitado muestra que los ADN y ARN mitocondriales no pueden jugar más que un papel biológico reducido. Además, parece claro que las mitocondrias son incapaces de replicar su ADN en los fragmentos anucleados de los huevos de erizo de mar: su autonomía de cara al núcleo se limita así a la síntesis de los ARN mitocondriales y quizás de algunas proteínas mitocondriales. La Acetabularia, alga unicelular gigante (S cm de longitud), puede cortarse fácilmente en dos: los dos fragmentos son capaces de regenerar y formar una estructura compleja, el "sombrero" o umbrela (fig. 1). Experiencias de injerto han mostrado claramente que la formación del sombrero está controlada por "sustancias morfogenéticas" producidas por los genes del núcleo y no por el ADN de los cloroplastos o de las mitocondrias (Hämmerling).

Los fragmentos anucleados son asimismo capaces de sintetizar numerosas proteínas, entre ellas enzimas específicas. Estas experiencias (y muchas otras que no pueden resumirse aquí) han llevado a la conclusión de que la sustancias morfogenéticas son en realidad una familia de ARN mensajeros; producidos por el núcleo, podrían "sobrevivir" en el cito­plasma anucleado durante semanas, incluso meses.

La Acetabularia contiene rnillones de cloroplastos, cada uno de los cuales lleva ADN. Estos cloroplastos tienen una amplia autonomía de cara al núcleo: pueden replicar su ADN, multiplicarse, sintetizar ARN y proteínas cloroplásticas en ausencia del núcleo. Pero esta autonomía dista mucho de ser completa: algunas enzimas presentes en los cloroplastos son sintetizadas por los genes nucleares; la multiplicación de los cloroplastos, en ausencia del núcleo, es lenta y cesa tras algunos días. Finalmente, experiencias hechas con venenos que afectan preferentemente a la síntesis de los ADN cloroplásticos y mitocondriales han llevado a la conclusión de que no son éstos los que dirigen la regeneración y formación de los sombreros. La morfogénesis es, por tanto, obra de los genes nucleares que actúan por medio de mensajeros estables.

El conjunto de estas investigaciones permite concluir que no se puede explicar la morfogénesis por intervención de plasmagenes. Las experiencias de que hablaremos a continuación no harán sino reafirmar esta conclusión.

Los métodos clásicos de la genética (hibridación, aislamiento de mutantes) san preciosos para analizar el papel de los genes en la diferenciación celular

Nuestros conocimientos en este importante campo son por desgracia aún muy limitados. Cuando se fecundan huevos de erizo de mar por espermatozoides de otra especie, los híbridos son frecuentemente letales: mueren ya sea al comienzo de la gastrulación, ya sea en un estado larvario más tardío. En este último caso, los caracteres paternos aportados por el espermatozoide no se manifiestan hasta después de la gastrulación. Estos hechos confirman que no es sino en este estadio cuando los genes llegan a ser realmente activos. En el caso de los híbridos letales precoces, puede mostrarse que se produce una síntesis excesiva de mensajeros paternos: los mecanismos de control, que (imitan normalmente la transcripción del ADN, resultan, por tanto, ineficaces cuando se trata de la transcripción de un ADN extraño. Estos mismos híbridos sintetizan cantidades apreciables de proteínas paternas y puede pensarse que la letalidad se debe a la acumulación de estas proteínas extrañas al citoplasma, que es de origen exclusivamente materno.

Ciertas mutaciones que detienen el desarrollo en una fase precoz presentan gran interés. Hemos hablado ya de la mutación nu-o en el Xenopus: después de una deleción de organizadores nucleolares (con pérdida del r-ADN), son incapaces de formar nucléolos y sintetizar los r-ARN. El mutante (o) del ajolote es letal, en el estado homocigótico, desde la gastrulación; pero el desarrollo se hace normal si se inyecta, en los huevos fecundados del mutante, el jugo nuclear de un oocito normal. Los factores que están presentes en el núcleo del oocito y que son capaces de corregir la mutación (o) son probablemente proteínas sintetizadas bajo la dirección de cromosomas plumosos.

La existencia de letales precoces, después de la hibridación o a continuación de una mutación, demuestra claramente la necesidad de una constitución genética normal para que el desarrollo sobrepase la gastru­lación.

El problema de la diferenciación celular se remite al del control de la actividad genética

Cuando el sistema nervioso se forma, después de una inducción, no posee aún células nerviosas (neuronas) diferenciadas desde el punto de vista morfológico, fisiológico y bioquímico: la diferenciación celular tiene lugar después de la organogénesis con un retraso de algunos días. La figura 13 da un ejemplo de diferenciación celular: se ve, de un lado a otro, células musculares y cartilaginosas; tienen el mismo origen embriológico (mesodér­mico), pero las primeras presentan una estriación característica debida a la presencia de proteínas contráctiles (actina y miosina), mientras que las segundas están rodeadas de una matriz homogénea formada por azúcares y proteínas (condroproteínas).

La naturaleza de los factores, genéticos y otros, que controlan la diferenciación celular sigue siendo uno de los problemas de la biología moderna. El enigma se ha hecho aún más oscuro por el hecho que nosotros sabemos, después de las experiencias de Gurdon (fig. 6), que todos los núcleos de las células diferenciadas poseen los mismos genes que el huevo fecundado. No hay pues diferencia genética fundamental entre las células musculares y cartilaginosas representadas en la figura 13. Sin embargo, sintetizan proteínas diferentes: hay que admitir,por tanto, que la síntesis de la actina y de la miosina está reprimida en las células cartilaginosas, mientras que la de las condroproteínas no se produce en las células musculares. El problema de la diferenciación celular se remite, pues, esencialmente al del control de la actividad genética; ¿por qué los genes de las condroproteínas están reprimidos en una célula muscular, mientras que se expresan en una célula cartilaginosa? Se piensa, actualmente, que este control de la actividad genética lo realizan las proteínas (básicas y no básicas) asociadas a los cromosomas. Es muy probable, pero los experimen­tos absolutamente decisivos aún faltan.

Esperando que el futuro traiga una solución al complejo problema de la regulación de la actividad genética en las células en vía de diferenciación, cabe decir algunas palabras sobre los sistemas biológicos prometedores para el estudio experimental de la diferenciación celular. El más natural de estos sistemas es el embrión mismo, pero la existencia de gradientes morfogené­ticos, de fenómenos de regulación embrionaria y de inducción complica el análisis experimental. Por esto muchos investigadores prefieren trabajar con células embrionarias cultivadas in vitro.

Entre los numerosos experimentos que se hacen actualmente con estas células, hay dos que merecen un interés muy particular. En primerísimo lugar, los experimentos de fusiones celulares, que permiten realizar los híbridos somáticos. Si, como lo han hecho Ephrussi y sus colaboradores, se fusiona una célula diferenciada (una célula pigmentada, una célula nerviosa o una célula hepática, por ejemplo) con una célula embrionaria aún indiferenciada, la diferenciación se pierde enseguida: el pigmento o las proteínas características del sistema nervioso o del hígado cesan de sintetizarse. El citoplasma de la célula indiferenciada ejerce, pues, un control negativo: reprime la síntesis de las proteínas específicas, características de la célula diferenciada. La interpretación de estas interesantes experiencias es, desgraciadamente, un poco complicada ya que los híbridos somáticos (como por otra parte los híbridos entre erizos de mar de los que hemos hablado antes) tienden a perder una parte de sus cromosomas en el citoplasma.

Figura 13. Ejemplo de diferenciación celular en el transcurso del desarrollo embrionario: formación de células cartilaginosas (c) y musculares (m) en un joven renacuajo de rana. Las células cartilaginosas están situadas en celdillas (flechas) rodeadas por una matriz homogénea formada por condroproteínas. Las células musculares están formadas por fibrillas alargadas. La diferenciación embrionaria no ha terminado aún en esta fase del desarrollo: las células cartilaginosas se transforma­rán ulteriormente en células óseas; las fibras musculares no poseen aún la estriación característica representada en la figura 2. Las células cartilaginosas y musculares tienen el mismo origen embriológico (mesodermo) y poseen los mismos genes; son, no obstante, morfológica y bioquímicamente diferentes. El problema de la diferenciación celular se remite al del control de la actividad de los genes; su solución debería permitir hacer grandes y rápidos progresos en el dominio de la oncología.


El otro tipo de experimento es muy diferente, pero conduce al mismo resultado: la pérdida de la diferenciación celular. Si se le añade a estas células en vía de diferenciación bromodeoxiuridina (BUDR), se detiene selectivamente la diferenciación. Células bien diferenciadas incluso pueden perder su diferenciación y volver a un estado indiferenciado. Por ejemplo, las células musculares embrionarias no forman proteínas contráctiles en presencia de BUDR; en estas condiciones las células cartilaginosas no sintetizan condroproteínas y la producción de pigmento es impedida en las células pigmentadas. Tratando un embrión muy joven de pollo con BUDR, se impide selectivamente la síntesis de hemoglobina y la formación de glóbulos rojos. La BUDR reacciona, en la mayor parte de los casos, modificando el ADN: en efecto, esta sustancia es un "análogo" de la timidina, precursor natural del ADN. Los efectos de la BUDR (que reacciona, además, probablemente también sobre las membranas celulares) impiden selectivamente la síntesis de las proteínas específicas de células diferenciadas (proteínas de lujo, de Holtzer) sin afectar a la de las proteínas comunes, presentes en toda célula (proteínas caseras de Holtzer)

Holtzer sugirió la posibilidad de que la BUDR impediría la amplificación de los genes responsables de la síntesis de las "proteínas de lujo": estos genes existirían bajo la forma de un mayor número de copias en las células que van a sintetizar la proteína específica de su tejido. Pero observaciones recientes tienden a demostrar que no hay amplificación de genes de la hemoglobina en las células madres de los glóbulos rojos: su número (probablemente cuatro) es el mismo que en todas las demás células.

El modo de acción de la BUDR queda, pues, oscuro; pero no por ello queda menos claro que esta sustancia constituye un preciosísimo utensilio para el análisis de la diferenciación celular.

De la ficción a la realidad

Los que han tenido la ocasión de seguir de cerca el desarrollo de la embriología molecular en el transcurso de los 40 últimos años sin duda estarán maravillados por el gigantesco progreso que ha tenido lugar. Es cierto que viejos problemas de otros tiempos continúan planteándose a la embriología de hoy, pero de forma mucho más concreta. Ya Buffon y sus contemporáneos discutían la importancia relativa de la "preformación" y de la "epigenesis" durante el desarrollo embrionario. Hoy la preformación corresponde al almacenamiento de moléculas informativas acumuladas durante la oogénesis; la epigénesis corresponde a la adquisición de informaciones nuevas, después de una activación secuencial y selectiva de genes determinados.

Sería en vano querer jugar al profeta e intentar predecir lo que será el porvenir de la embriología molecular y lo que aportará a la humanidad. Se puede pensar, sin embargo, sin gran riesgo de equivocarse que aportará contribuciones importantes a dos problemas que preocupan al hombre de 200

hoy: el cáncer y las enfermedades hereditarias. El cáncer es una enfermedad celular caracterizada por la ausencia de diferenciación; cuando comprendamos mejor los mecanismos de la diferenciación celular, podremos buscar, de manera lógica, armas contra el cáncer: quizás fuera mejor intentar forzar las células cancerosas a diferenciarse que intentar matarlas, como se hace hoy.

En cuanto a las enfermedades hereditarias, se puede esperar corregirlas introduciendo, en el huevo o en el embrión, el ADN normal: la cosa debería intentarse, sobre el plano experimental, en el caso de las hemoglobinopatías, en donde se forman unas hemoglobinas anormales. En efecto, ya podemos aislar el mensajero de la hemoglobina humana y actualmente los esfuerzos se encaminan a sintetizar el gen correspondiente partiendo de este mensajero.

Quizás no sean más que sueños; pero el pasado reciente de la embriología molecular muestra claramente que la realidad superará pronto lo que nos parece aún que no es más que una ficción.